ไดอานา ฟรานเซส สเปนเซอร์ เกิดเมื่อวันเสาร์ที่ 1 กรกฎาคม พ.ศ. 2504 ในพาร์กเฮาส์ เมืองซานดริงแฮม มณฑลนอร์ฟอล์ก เธอเป็นบุตรีคนสุดท้ายและบุตรคนที่สามจากทั้งหมด 5 คนของ จอห์น สเปนเซอร์ ไวเคานท์อัลธอร์พ (พ.ศ. 2467–2535) และภริยาคนแรก ฟรานเซส โรช (พ.ศ. 2479–2547)[3] ตระกูลสเปนเซอร์มีสายสัมพันธ์แน่นแฟ้นกับราชวงศ์อังกฤษมานานหลายชั่วอายุ[4] ทั้งย่าและยายของไดอานาต่างเคยปฏิบัติหน้าที่นางสนองพระโอษฐ์ในสมเด็จพระราชินีเอลิซาเบธ พระราชชนนี[5]  ในช่วงเวลานั้นไวเคานต์หวังให้ทารกในครรภ์ที่ 3 (ไดอานา) กำเนิดเป็นเพศชาย เพื่อจะได้สืบทอดตำแหน่งขุนนางตระกูลสเปนเซอร์ต่อไป อีกทั้งไม่ได้มีการเตรียมชื่อเด็กหญิงไว้ล่วงหน้า จนกระทั่งหนึ่งสัปดาห์ผ่านไปฟรานเซสจึงตั้งชื่อทารกเพศหญิงผู้นี้ว่า ไดอานา ฟรานเซส ซึ่งได้นามต้นมาจากญาติห่าง ๆ ของเธอคือ ไดอานา รัสเซล ดัชเชสแห่งเบดฟอร์ด (พ.ศ. 2253–2278) หรือ เลดี้ไดอานา สเปนเซอร์​ ในนามเดิมก่อนการสมรส และเลดี้ไดอานาผู้นี้เคยถูกคาดหวังให้อภิเสกสมรสกับเจ้าชายเฟรเดอริก เจ้าชายแห่งเวลส์ (พ.ศ. 2250–2294)[6]

ด้านหน้าคฤหาสน์อัลธอร์พซึ่งเป็นบ้านประจำตระกูลสเปนเซอร์

ไดอานาเข้ารับพิธีศีลล้างบาปในวันที่ 30 สิงหาคม พ.ศ. 2504 ณ โบสถ์เซนต์แมรีแมกดาลีน เมืองซานดริงแฮม และมีเศรษฐีผู้มั่งคั่งรับเป็นลูกทูนหัว[7] ไดอานามีพี่น้องรวม 4 คน ดังนี้ ซาราห์ (ปัจจุบันคือ เลดี้ซาราห์ แมคคอร์เคอเดล), เจน (ปัจจุบันคือ เจน เฟลโลวส์ บารอนเนสเฟลโลวส์) และชาลส์ (ปัจจุบันเป็น เอิร์ลแห่งสเปนเซอร์ที่ 9)[8] ส่วนจอห์น พี่ชายเสียชีวิตขณะยังเป็นทารก ราว ๆ 1 ปีก่อนไดอานากำเนิด[9]  ความต้องการลูกชายไว้สืบทอดวงศ์ตระกูลสร้างแรงกดดันให้กับครอบครัวสเปนเซอร์ ซึ่ง ณ ขณะนั้นมีบุตรสาวอยู่แล้วถึง 2 คน[10][9] ดังนั้นมีการเล่าลือกันว่าเลดี้อัลธอร์พถูกนำตัวไปตรวจร่างกายที่คลินิกสูตินรีเวชย่านถนนฮาร์ลีย กรุงลอนดอน เพื่อตรวจหา ”ความผิดปกติ” ชาลส์ เล่าถึงความอับอายของมารดาว่า “เป็นช่วงเวลาเลวร้ายในครอบครัวและอาจเป็นจุดเริ่มต้นของการหย่าร้าง และพ่อแม่คงไม่มีวันลืมสิ่งต่าง ๆ ที่เกิดขึ้น”[8] ไดอานาเติบโตในคฤหาสน์พาร์กเฮาส์ซึ่งตั้งอยู่ภายในอาณาเขตของตำหนักซานดริงแฮม[8]  โดยครอบครัวสเปนเซอร์เช่าคฤหาสน์หลังนี้จากสมเด็จพระราชินีนาถเอลิซาเบธที่ 2  ผู้เป็นเจ้าของ สมาชิกราชวงศ์อังกฤษมักเสด็จมาประทับที่ตำหนักซานดริงแฮมนี้เป็นประจำทุกปี และไดอานายังเคยร่วมเป็นเพื่อนเล่นของเจ้าชายน้อยสองพระองค์ คือ เจ้าแอนดรูว์ เจ้าชายเอ็ดเวิร์ด พระราชโอรสของสมเด็จพระราชินี[11][12]

บิดามารดาของไดอานาหย่าร้างกันเมื่อไดอานาอายุได้ 7 ปี ฟรานเซสมีความสัมพันธ์กับ ปีเตอร์ ชานด์ คิดด์ และต่อมาได้เข้าพิธีสมรสกับชายคนนี้ใน พ.ศ. 2512[13] โดยไดอานาย้ายไปพักอยู่กับมารดาที่ลอนดอนระหว่างที่การแยกกันอยู่ในปีช่วงปี พ.ศ. 2510 แต่ในวันหยุดคริสต์มาสปีเดียวกันนั้น ลอร์ดอัลธอร์พไม่ยินยอมให้ไดอานากลับลอนดอนพร้อมกับฟรานเซส และในเวลาต่อมาบิดาชนะคดีฟ้องร้องสิทธิในการเป็นผู้ปกครองของไดอานา ซึ่งได้รับความช่วยเหลือทางคดีจากอดีตแม่ยาย รูธ โรช บารอนเนสเฟอร์มอย[14]

พ.ศ. 2515 ลอร์ดอัลธอร์พตกหลุมรัก เรน เคาน์เตสแห่งดาร์ตมัธ บุตรีคนเดียวของ อเล็กซานเดอร์​ แมคคอเคอร์เดล และท่านผู้หญิงบาร์บารา คาร์ทแลนด์ ทั้งสองจดทะเบียนสมรสที่แค็กซ์ตันฮอลล์ กรุงลอนดอนเมื่อปี พ.ศ. 2519[15]

พ.ศ. 2518 ไดอานาได้เลื่อนบรรดาศักดิ์เป็น เลดี้ [16] ภายหลังที่พ่อสืบทอดบรรดาศักดิ์เป็นเอิร์ลแห่งสเปนเซอร์ ครอบครัวสเปนเซอร์จึงต้องย้ายออกจากพาร์กเฮาส์ เพื่อกลับไปพักอาศัยที่ยังคฤหาสน์อัลธอร์พอย่างถาวร โดยคฤหาสน์แห่งนี้คือบ้านประจำตระกูลสเปนเซอร์ตั้งอยู่ในมณฑลนอร์ทแธมป์ตัน[17]

ด้านหน้าอาคารโรงเรียนสตรีเวสต์ฮีธที่ไดอานาเคยเล่าเรียนพร้อมกับพี่สาว ซาราห์และเจน (ปัจจุบันเปลี่ยนชื่อเป็น โรงเรียนนิวสกูลแอทเวสต์ฮีธ และดำเนินการสอนภายใต้การอุปถัมภ์หลักของนายโมฮัมเหม็ด อัลฟาเยด มาตั้งแต่ พ.ศ. 2541)[18]